標題：《RNA甲基化因子對腎透明細胞癌預后價值的探討和驗證》

摘要：【目的】腎透明細胞癌(clear cell Renal Cell Carcinoma ccRCC)是高發(fā)的一類惡性腫瘤,罹患率和死亡率居高不下,因此研究ccRCC的致病機制,尋找新的分子治療靶向位點是十分必要的。RNA甲基化是重要的轉錄后修飾方法,既往研究已發(fā)現多個RNA甲基化調節(jié)因子與惡性腫瘤密切相關,但全面探討RNA甲基化因子對ccRCC臨床病理影響的報道相對較少,因此本課題應用生物信息學分析開展RNA甲基化調控因子與ccRCC關系的研究,進而用細胞和組織實驗對生信結果進行驗證?！痉椒ā?、從癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數據庫的ccRCC全基因表達譜中提取48個RNA甲基化調控因子的表達隊列,從中篩選差異表達基因;對差異表達基因進行功能注釋;利用單因素cox分析篩選與ccRCC預后相關的差異表達基因。2、用R包“Consensus Cluster Plus"對預后相關的差異表達基因進行無監(jiān)督聚類分型,分析不同分型ccRCC的預后情況,在分型中進行富集分析,比較不同分型中免疫微環(huán)境的差異。3、用“glmnet"包中的Lasso cox方法,基于有預后價值的RNA甲基化因子構建ccRCC的風險評分模型,結合風險評分建立列線圖以量化風險評分的預后能力。4、結合多因素cox分析和文獻檢索篩選出進一步分析的一個關鍵因子。5、利用RNA定量逆轉錄PCR(quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)實驗和Western Blot(蛋白質印跡法)檢測ccRCC細胞株中關鍵因子的mRNA和蛋白表達情況。6、利用RT-qPCR實驗分析目的基因在新鮮ccRCC組織和癌旁腎組織中的mRNA表達情況。7、隨機選取ccRCC石蠟組織進行免疫熒光實驗,明確目的蛋白在癌和正常組織中的表達模式。選取我院2014年-2018年經病理科確診的80例ccRCC石蠟標本,進行關鍵因子的石蠟組織免疫組化實驗,比較目的蛋白在癌組織和正常腎組織中的表達差異。8、聯合80例ccRCC石蠟組織中目的蛋白的免疫組化結果和腫瘤發(fā)病部位、腫瘤直徑、性別、年齡、有無脈管內癌栓、腫瘤ISUP分級、腫瘤分期、Ki-67指數等臨床病理參數進行相關性分析;探究目的蛋白對ccRCC生存預后的影響,結合臨床病理參數進行單因素和多因素cox分析,最后聯合臨床參數構建預后列線圖模型?！窘Y果】1、納入的48個RNA甲基化調節(jié)因子在ccRCC中有39個呈現表達差異,其中24個基因表達上調,15個基因表達下調。差異表達基因的功能注釋結果顯示它們與各類RNA的甲基化修飾和物質代謝有關。2、39個差異表達基因的單因素cox分析顯示有12個因子與ccRCC的預后有關(P<0.05),以這些因子的表達數據為基礎,可以將TCGA數據庫中的ccRCC患者聚類為1和2兩種分子類型。卡曼(Kaplan-Meier,K-M)生存分析顯示2型患者的生存預后明顯差于1型患者;富集分析結果顯示2型分子分型主要與物質代謝有關,2型患者的免疫評分明顯高于1型(P<0.05),2型中CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、髓源性抑制細胞(myeloid derived suppressor cells,MDSC),單核細胞等免疫細胞的浸潤程度明顯高于1型(P<0.01)。3、將12個預后因子納入Lasso cox中分析,獲得一個7基因風險評分模型:Risk Score=0.571*NOP2+0.393*NSUN6-0.313*TRMT61B-0.049*ALKBH1+0.185*NSUN5-0.343*TET2+0.02 6*DNMT3B。7個基因中,4個為危險因子(NOP2、NSUN6、NSUN5、DNMT3B),與ccRCC的不良預后有關;3個為保護因子(TET2、TRMT61B、ALKBH1),與相對好的預后有關。利用風險評分進行分組,然后進行K-M分析,低評分組患者的生存時間明顯長于高評分組患者(P<0.001);單因素和多因素cox分析結果顯示:風險評分、年齡、分期和分級是ccRCC的獨立預后因素(P<0.05)。利用這些獨立預后因子,構建出一個預測ccRCC 1年、3年和5年生存率的列線圖。4、基于多因素cox分析和文獻檢索將風險評分模型中的構成因子NOP2確定為進一步實驗驗證的關鍵基因。5、ccRCC細胞株中NOP2 mRNA(P=0.0271)和蛋白質(P=0.0129)的相對表達量均高于正常腎小管上皮細胞株。6、NOP2 mRNA在ccRCC新鮮組織(P=0.0082)中較正常腎組織顯著上調。免疫熒光實驗顯示NOP2蛋白在ccRCC中的表達模式主要為核陽性染色,在正常腎組織中的表達模式主要為細胞質或細胞膜陽性染色,而少見核陽性表達。免疫組化中NOP2蛋白的表達模式和定位與免疫熒光相同。結合文獻以核陽性率作為NOP2蛋白表達情況的評價指標,ccRCC組織中的NOP2核陽性率為42.9±15.7%,癌旁腎組織中的核陽性率為14.1±13.5%,統計結果表明ccRCC癌組織中的NOP2蛋白表達量明顯高于正常腎組織(P<0.001)。7、以核陽性率的中位數43.67%作為截斷值將患者分為NOP2蛋白高表達組和NOP2蛋白低表達組,統計結果顯示高NOP2蛋白表達組與ccRCC高腫瘤分級(3級和4級,P<0.001)和高Ki-67指數(P=0.0035)有關,但年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、腫瘤分期、有無癌栓和性別等參數在不同NOP2蛋白表達組間未獲得統計學差異。8、NOP2蛋白表達與ccRCC患者的總生存時間(Overall Survival,OS,P=0.0015)和無進展生存時間有關(Progression-Free Survival,PFS,P<0.001),NOP2蛋白表達高表達組的OS和PFS差于低表達組。對NOP2蛋白表達及其它臨床病理參數進行單因素和多因素cox分析,在單因素分析中NOP2蛋白表達(P=0.0072)和腫瘤分級(P=0.015)與患者的OS相關;多因素cox分析中NOP2蛋白表達(P=0.041)與患者OS有關,是ccRCC的獨立預后因素。最后以NOP2蛋白表達等參數為基礎,可以構建預測ccRCC患者生存率的列線圖模型?！窘Y論】1、ccRCC中存在多個差異表達的RNA甲基化調控因子,且與該病的預后相關。2、基于預后相關的RNA甲基化調控差異表達因子可以將ccRCC患者分為1型和2型,2型患者的預后差于1型,這種差異形成的原因可能與2型患者中代謝功能紊亂引起的免疫抑制有關。3、通過機器學習模型構建的7基因風險評分模型對ccRCC有較強的預后評估能力,并且風險評分、年齡、分期、分級是ccRCC的獨立預后因素,這些因素聯合建立的列線圖可以實現預后能力的量化。4、RNA甲基化調節(jié)關鍵因子NOP2的mRNA和蛋白表達在ccRCC組織和細胞系中均顯著上調,并且NOP2mRNA和蛋白的高表達均與ccRCC患者的不良預后有關。5、NOP2蛋白表達是ccRCC的獨立預后因素,可能參與該腫瘤的疾病進展,在ccRCC中發(fā)揮促癌作用。